Terapia Génica para Cáncer de Pulmón por Medio de Silenciamiento Génico
El presente artículo hace alusión a un nuevo tratamiento del cáncer de pulmón mediante silenciamiento génico. Ya que esta enfermedad afecta a gran cantidad de personas en el mundo.
Paulina Franco
9 de May · 4022 palabras.
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🕘 Resumen
El cáncer de pulmón sigue siendo uno de los tipos de cáncer más mortales a pesar de los avances en el diagnóstico y tratamiento. Este tipo de cáncer es causado principalmente por el tabaquismo y el humo de segunda mano. La técnica de silenciamiento por RNA de interferencia (iRNA) se ha vuelto muy famosa para estudios de activación y desactivación de genes y se puede considerar una poderosa herramienta biomédica para el tratamiento de enfermedades hasta ahora incurables. En el caso específico del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) juega un papel importante ya que modula la proliferación y el crecimiento neoplásico. Cuando este receptor sufre una mutación, promueve el crecimiento continuo de las células, lo que lo convierte en un objetivo importante para el tratamiento contra el cáncer. Se sabe que los inhibidores de tirosina quinasa son eficaces en la inhibición de la proliferación celular en pacientes con NSCLC con mutaciones de EGFR. La utilización de iRNA para desactivar el gen EGFR es un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer de pulmón.El cáncer de pulmón es una enfermedad que causa una gran cantidad de muertes, a pesar de que ha habido mejoras en el diagnóstico y tratamiento continúa siendo uno de los cánceres que causan más muertes. Es causado por el tabaquismo y puede ser también causado si se es fumador pasivo. (Lee, y otros, 2013)
El silenciamiento por RNA de interferencia (iRNA) es un mecanismo de silenciamiento génico post-transcripcional por RNA de doble cadena (dsRNA). (Hannon, 2002). Éste evento ocurre naturalmente en la célula, dentro del núcleo, miRNA, o fuera de la célula por medio de infección de virus, transfección etc. Este último también puede ser inducido para reducir o inactivar algún gen por medio de siRNA, que son dsRNA diseñados para secuencias específicas que se quieren estudiar. Dicho silenciamiento ocurre al introducir el siRNA diseñado para que al instante en que entre a la célula, comience el proceso de silenciamiento por medio de diversas proteínas como el Dicer y el complejo RISC. (Judge, y otros, 2009)
Ésta técnica se ha hecho famosa para diversos estudios de activación e inactivación de genes, y ha dado hincapié a un nuevo panorama con la llamada terapia génica, ya que el uso de iRNA puede ser una poderosa herramienta biomédica para tratamiento de enfermedades que hasta el momento son incurables. (Chang, Kim, Dua, Kim, Lee, & Dong-ki, 2011)
En el cáncer de pulmón específicamente en el tipo de células no pequeñas (NSCLC), el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), tiene un gran papel, debido a que éste receptor modula la proliferación y crecimiento neoplásico por traducción de señales. Cuando se tiene una sobre expresión de este receptor comúnmente hay presencia de tumores, según varios estudios. (Lee, y otros, 2013)
Éste factor tiene un papel importante, ya que cuando sufre una mutación, éste promueve el crecimiento continuo de las células, por lo que si se tiene presencia de cáncer, hará que se produzca una infestación, haciendo así que sea mucho más complicado de tratar, debido a que puede abarcar órganos cercanos a los pulmones.
El proceso de silenciamiento génico por iRNA’s puede ser utilizado para la inactivación del gen del EGFR cuando tiene una mutación, ya que éste fenómeno causa que las células continúen creciendo alterando su ciclo y siendo propenso a crecimiento de células tumorales. La terapia génica es un arma posible para éste tipo de enfermedades, y el cáncer de pulmón es una de las que más muertes causa en todo el mundo.
Se han hecho estudios en donde se ha demostrado una disminución de proliferación de células tumorales en ratones haciendo uso de siRNA que inhiban al EGFR, por lo que se considera como un tipo de terapia posible y con mucho futuro. (Judge, y otros, 2009)
Sin embargo un problema que con los años se ha ido incrementando y se ha visto como una amenaza es que estudios han demostrado que hay parte de la población que puede presentar cáncer de pulmón sin nunca haber tenido historial de tabaquismo. Esto se presenta debido a mutaciones en receptores como el EGFR y KRAS. Las mutaciones pueden ocurrir debido a muchos fenómenos, y es común que una persona esté predispuesta a sufrir esto por diferentes factores, como lo son el ambiente, es decir, si se es fumador pasivo, historial familiar, entre otros. (Gaughana, Cryerb, Yeapc, Jackmanb, & Costa, 2013)
Estadísticas
El cáncer de pulmón denominado por sus siglas como CAP, es el responsable de la muerte de aproximadamente 1.4 millones de personas en el mundo al año (Milenio, 2012). Representando una mayor prevalencia en países ubicados en América del Norte (El Universal, 2011). De acuerdo a datos publicados por la OMS, el cáncer es una de las primeras causas de muerte en el mundo, siendo el cáncer de pulmón uno de los más letales junto con el de estómago, hígado, colon y mama.
En México cada año se diagnostican 10 mil casos de la enfermedad, donde de acuerdo al Instituto Nacional de Cancerología (INCAN), el cáncer diagnosticado se encuentran en etapas avanzadas. El INCAN tiene su ubicación en el Estado de México y anualmente registra la atención médica de 250 nuevos casos; sin embargo el 90% de los pacientes fallece antes de los 18 meses de haberse diagnosticado la enfermedad. Y sólo el 7% sobrevive al menos 5 años después del diagnóstico (El Universal, 2011).
De acuerdo al oncólogo Óscar Arrieta, Coordinador de la Clínica de Cáncer de Pulmón y Cáncer de Tórax en el INCAN, el cáncer de pulmón representa el 18% de todas las muertes atribuidas al cáncer. Donde el 13% del total de cánceres registrados son de pulmón (El Universal, 2011). La incidencia del cáncer se presenta tanto en mujeres como en varones, no obstante el porcentaje es mayor en éstos últimos. Representando la segunda causa de muerte en varones y la octava en mujeres, según el reporte GLOBOCAN de la OMS en el 2008 (Pfizer, 2012).
Uno de los factores de riesgo que potencializa la posibilidad de padecer CAP, es el tabaquismo, ya que se le atribuye el 71% de las muertes (OMS, 2013). Principalmente porque se han identificado alrededor de 50 carcinógenos en el humo del tabaco (Milenio, 2012). Dicho vicio provee a las mujeres el doble de probabilidades de desarrollar cáncer de pulmón que los varones. Lo cual sustenta que a pesar de representar una mayor incidencia para los varones, se ha encontrado que las mujeres son más susceptibles a padecer este tipo de cáncer, de acuerdo a lo expresado por el oncólogo Óscar Arrieta (Milenio, 2012).
La edad en la que mayormente se presenta la enfermedad es en personas mayores, considerando que 8 de cada 10 casos de cáncer se presentan en personas de 60 años o mayores (Milenio, 2012). De acuerdo a estimaciones actuales, tomando como referencia el número de casos mundiales registrados de cáncer de pulmón, se estima que para el año 2025 la cifra de diagnósticos aumentará a 3.5 millones de personas en países desarrollados (Pfizer, 2012).
Desarrollo
En la actualidad los tratamientos contra el cáncer de pulmón son cirugía, quimioterapia, terapia de radiación o alguna combinación de las anteriores. Por lo que se han buscado formas para tratar a los pacientes con métodos menos agresivos, ya que los anteriormente mencionados afectan al propio organismo o son invasivos.
En Estados Unidos y en Japón se aprobó el uso de gefitinib para el cáncer de pulmón de células no pequeñas, ya que es un inhibidor de la tirosina quinasa de éste receptor, debido a su mutación, lo que causa que éste se apague controlando el crecimiento de las células. (Paez, y otros, 2004).
También se tiene otro medicamento que tiene en sí la misma función que el gefitinib, el erlotinib actúa también como un inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR. Se ha comprobado así mismo que las mutaciones de éste son debido a una deleción en el exón 19 y la sustitución del aminoácido leucina por arginina en el codón 858 del codón 21. Estas dos mutaciones se refieren al 85-90% de todas las mutaciones en el EGFR. (Tabara, K., et al, 2012)
A pesar de esto, aún no hay terapia dirigidas hacia éste receptor, solamente para el iniciador más común de carcinogénesis de pulmón que viene siendo el mutante KRAS. Las mutaciones de éste conforman del 20-25% del cáncer de pulmón de células no pequeñas. (Gerner, 2011)
Pocos años después, se comenzó a hacer uso de siRNAs para el tratamiento de enfermedades del pulmón, ya que ejercen un efecto biológico al guiar la degradación de la secuencia de su mRNA conjugado, bloqueando con ello la correspondiente producción de proteínas (silenciamiento génico por RNA de interferencia o iRNA). Debido a esta propiedad, los siRNAs se perfilaron como prometedores agentes terapéuticos para el tratamiento de las enfermedades hereditarias y adquiridas, así como herramientas de investigación para el esclarecimiento de la función de genes en la salud y en la enfermedad. Dada su letalidad y prevalencia, las enfermedades pulmonares atrajeron una atención especial como objetivos de curas mediadas por siRNA. Aunado a esto, el pulmón puede tener acceso a los agentes terapéuticos a través de múltiples rutas, por ejemplo a través de la nariz y la boca, evitando así la necesidad de focalización, por lo que es un objetivo atractivo para estrategias terapéuticas basadas en iRNA. Sin embargo, el éxito clínico de las intervenciones por siRNA depende críticamente de la seguridad y la eficacia de los métodos de administración y agentes utilizados. La introducción de siRNAs correspondientes a las enfermedades de pulmón se intentó a través de la infección con el virus de la influenza por vía intravenosa y respiratoria en monos y ratones, obteniendo resultados favorables pero no óptimos, por lo que se consideró que el estudio de esta tecnología era prometedor para las terapias del futuro. (Thomas et al., 2007)
Posteriormente se realizaron diversos análisis del efecto terapéutico del silenciamiento génico por iRNA sobre cáncer de pulmón. Para esto se realizaron pruebas experimentales in vitro sobre la línea celular A549, donde se silenció el receptor del factor de crecimiento “insulin-like” tipo I (IGF-IR), el cual es comúnmente sobrexpresado en cáncer (incluyendo cáncer de pulmón) y modula la proliferación de células cancerígenas y el crecimiento de tumores. Utilizaron el promotor humano U6 de DNA molde para inducir horquillas de RNA (hpRNA) accionadas al iRNA para silenciar la expresión génica de IGF-IR y después evaluaron sus efectos sobre la apoptosis, apoptosis relacionada con la expresión génica y el crecimiento de los tumores in vitro. Con esto se logró la reducción de la expresión de IGF-IR en más del 78.9%, el incremento de activación de la caspasa-3, de la apoptosis y la inhibición del crecimiento de las células A549 in vitro. Así mismo se analizó el efecto in vivo, realizando la inyección directa de plásmidos de DNA (expresando hpRNA para IGF-IR) sobre tumores cancerígenos en ratones lampiños, donde se encontró la reducción de los tumores que ya se encontraban establecidos. Con estos resultados se reafirmó el potencial del iRNA como un método de terapia génica para tratar cáncer pulmonar (Dong et al., 2007). Otros estudios in vivo se realizaron en ratones en donde se hizo el knockdown de la expresión génica de señales transductoras y activadoras de la transcripción 3 (STAT3) con siRNA sobre pulmones con cáncer de Lewis transplantados. (Wang et al., 2008)
Se probaron múltiples estrategias para introducir el siRNA en el tratamiento de cáncer de pulmón, pues la introducción eficiente del siRNA en las células continuaba siendo un reto para la ciencia. Entre las que obtuvieron mejores resultados se encuentran las esferas compactas de un copolímero de baja densidad formado por chitosan-graft-polyethylenimina (CHI-g-PEI), las cuales mostraron una eficiencia alta de transfección de siRNA Akt1 con buena viabilidad celular in vitro e incluso in vivo vía aerosol, y así mismo mostraron un descenso significante en el crecimiento de células cancerígenas.
En la Figura 1 se muestra el proceso de silenciamiento in vitro utilizando el acarreador CHI-g-PEI, al cual es adicionado con una solución de siRNA para obtener complejos de 100pmol de concentración de siRNA, con el fin de silenciar la proteína reportera EGFP (lo que desencadena fluorescencia) y el oncogen Akt1. Con esto se logró incrementar los niveles de apoptosis y disminuir la proliferación de células cancerígenas de pulmón, por lo que se consideró a CHI-g-PEI como un buen medio transfectante para siRNA, sin embargo la formación del complejo es complicada debidio a la rigidez de la molécula y a su carga aniónica limitada. (Jere et al., 2009)
Recientes estudios han manifestado que los tratamientos con el uso de gefitinib y erlotinib (anteriormente mencionados) conocidos por sus siglas en inglés como EGFR-TKIs (tyrosine kinase inhibitors) han generado una buena respuesta en los pacientes enfermos; sin embargo en muchos casos el tratamiento ha resultado ineficiente, debido a que las células desarrollan resistencia a este fármaco al estarlo recibiendo por un periodo considerable de tiempo (Shien, K., y otros, 2012).
Una nueva forma de tratar el cáncer de pulmón principalmente de células no pequeñas según estudios publicados por científicos de Japón (2012), es mediante el uso de siRNA’s para el silenciamiento (knockdown) del gen que codifica para el factor del receptor de crecimiento epidérmico (Shien, K., y otros, 2012).
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), es una glicoproteína transmembranal con un peso molecular de 170,000 a 180,000 que se caracteriza por ser una familia de dominios (Min, Z., y otros, 2005). Dichos dominios se constituyen por tres, el primero de ellos es llamado extracelular de unión a ligando, el cual promueve una serie de respuestas celulares dirigidas a la proliferación celular. El segundo dominio es de transmembrana, refiriéndose al anclaje que se presenta entre éste y la membrana. Y finalmente el dominio citoplasmático tirosin quinasa, que origina la transducción de señales (De la Cruz, J., 2007). El EGFR es activado por unión con ligandos específicos como lo son el EGF, el “trasforming growth factor α (TGF α), considerados los más importantes y a los cuales se les pueden sumar el HB-EGF, amfiregulina, betacelulina, epiregulina y las regulinas neuregulinas 1-4. Sin embargo no se conoce un ligando activador directo, lo que hace más complicado el desarrollo de una técnica específica para su silenciamiento. Como se ha mencionado con anterioridad, éste ligando propicia la actividad intracelular de proteínas quinasas. Por consiguiente, se produce una autofosforilación de varios residuos de tirosina en el carbono terminal. Al fosforilarse estos residuos provocan la activación de una cascada de señalización, que a su vez activan cascadas de transducción de señales. En éste caso específico modularán la síntesis de DNA y la proliferación celular. Las rutas activadas más importantes son la MAPK, Akt y JNK. Dichas proteínas modulan la migración, adhesión y migración celular, que son principales blancos de las mutaciones observadas en cáncer. A esto se debe que éste receptor se haya convertido en una importante blanco para la generación de tratamiento para ésta enfermedad.
Según el estudio realizado por Shien, K., y sus colegas al realizar silenciamiento con siRNA’s dirigidos a diferentes regiones; siEGFR-1 (5’-GCU ACG AAU AUU AAA CAC UUC-3’ and 5’- AGU GUU UAA UAU UCG UAG CAU-3’) y siEGFR-2 (5’- CCG CAA AUU CCG AGA CGA AGC-3’ and 5’-UUC GUC UCGGAAUUUGCGGCA-3’) en células tumorales resistentes a EGFR-TKI, se observó que tuvo una represión total del p-EFGR (el gen EFGR fosforilado) a excepción de la línea celular NCI-H1650. Por lo cual se considera el silenciamiento génico por siRNA’s dirigidos al EFGR, como un tratamiento potencial del NSCLC cuando se encuentra activado el EFGR, aún en pacientes con resistencia a EFGR-TKI (Shien, K., y otros, 2012).
Hablando puntalmente en investigación sobre el receptor EGFR se amplificaron y secuenciaron los exones que codificaban para los bucles de activación de 47 de los 58 receptores humanos de quinasas (Paez y otros 2004). Dichas secuencias fueron extraídas de DNA genómico de 58 muestras de pacientes con cáncer, de las cuales incluían 41 adenocarcinomas de pulmón. Así mismo se encontró que tres de la muestras presentaron mutaciones heterocigotas en el EGFR, esto al ser comparadas con muestras de pulmón saludable.
Posteriormente se examinaron los exones 2 a 25, que son los más importantes para la codificación de proteínas que conforman el EGFR, los cuales están presentes en los exones 18 a 31 del dominio de los productores de quinasas. Se observaron deleciones múltiples de un nucleótido durante la comparación tejido sano contra enfermo. Los pacientes que presentaron éstas mutaciones fueron los que obtuvieron la respuesta más importante a las droga gefitinib.
Finalmente se determinó la eficacia del tratamiento por la droga gefitinib, de los cuales se tomaron 5 pacientes que respondieron al tratamiento y 4 pacientes que mejoraron durante el tratamiento. Durante éste paso de la experimentación se comprobó mediante análisis estadísticos que los pacientes que poseen las mutaciones mencionadas con anterioridad tuvieron 50 veces más sensibilidad al tratamiento que los que no.
Aunque existe información sobre terapia génica para la inhibición de éste receptor, el panorama es aún abrumador, ya que, queda aún por determinar un vehículo para la entrega de ácidos nucleicos lo suficientemente potente y si es viable en humanos. Los exámenes se han enfocado principalmente en el efecto de siRNA’s principalmente utilizando moléculas de dsRNA, sin embargo, al emitirse in vivo se logró una expresión baja, limitada al igual que su efecto en el tejido. Se debe mejorar el método de entrega de las cadenas de RNA para silenciamiento, mediante una técnica que permita una tasa alta de expresión, así como de un efecto con mayor potencia. Por lo que se ha propuesto el vector JDV de la enfermedad del virus de Jembrana bovina. El cual ha demostrado la capacidad de entrega de genes, tanto en etapas activas del ciclo celular y sin actividad durante ésta etapa. Dicho vector permite la entrega del dsRNA dirigido al EGFR llamado pjLPIIIRE y se utilizaron para los receptores de transducción de señales A549 y SCP-A1celular. Evaluando su efecto en ratones a 10 y 70 horas después de la infección se encontró que el 75% de las señales de A549 y el 80% de SPC-A1 se convirtieron en células EGFR negativas, lo que demostró el impacto altamente positivo del iRNA dirigido para EGFR.
Actualmente los medicamentos anteriormente mencionados (gefitinib y erlotinib) han ayudado a la disminución del crecimiento o del rápido avance del cáncer, terapia que ha sido aceptada debido a que es más eficiente que las quimioterapias y las radioterapias. (Petrelli, Borgonovo, Cabiddu, & Barni, 2012)
A pesar de los importantes avances logrados por la técnica mencionada anteriormente queda aún un largo camino para que pueda desarrollarse y salir a la venta como un producto de terapia clínico en cáncer en humano. Así mismo ha de considerarse la cuestión ética y el impacto genético que podrán traer éste tipo de tratamientos en el futuro.
Conclusión
A nivel mundial el cáncer de pulmón representa una de las principales causas de muerte. Los tratamientos que existen hoy en día aún son ineficientes, por lo que es necesario que se realicen nuevas investigaciones que puedan dar solución a este grave problema. La terapia génica es una ciencia que puede tratar la solución a este y otros problemas, ya que tiene varias ventajas, por ejemplo una persona que nace con un desorden genético puede beneficiarse con este método, remplazando su gen no funcional por un gen funcional, por lo que se tendría una nueva oportunidad de tener una vida normal.
Un paciente con cáncer podría beneficiarse de esta técnica mediante la inserción de vectores genéticamente modificados en el genoma humano. Debido a que la terapia génica implica cambios en el funcionamiento de los genes, la polémica se hace presente al plantearse cuestiones tanto éticas como técnicas. Si se cambia la información genética de las células incorrectas surge el riesgo de que esa información introducida pueda pasar a las células reproductivas y en consecuencia el paciente podría pasar esos genes a su descendencia, por lo que podrían variar las consecuencias.
Nuestro sistema inmunológico es muy efectivo al defender el cuerpo humano, cuando se introduce un nuevo gen por medio de algún vector (medio de inserción del gen) como un virus se corre el riesgo de que el cuerpo lo identifique como un agente maligno y lo ataque, produciendo serios problemas de salud o incluso la muerte. Además existen efectos secundarios a largo plazo que aún no se conocen.
A medida que avanzan los descubrimientos en el área de la terapia génica aumenta la posibilidad de tener nuevos tratamientos a las enfermedades que aún no tienen cura, se cree que en un futuro no muy lejano la terapia génica solucionara muchos de los problemas actuales que los tratamientos de hoy en día no pueden resolver.
Autores: Salvador Tovar López, Ian Luis Herrera Simpson, Paulina Lizet Franco Luna, José Alonso Ramos Aldana y Doddy Denise Ojeda Hernández.
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